Доброго дня, наші любі молоді науковці!

Продовжуємо наше цікаве дистанційне навчання і сьогодні йтиметься про селекцію і генетику!

Селекція і генетика – це серйозні і дуже відповідальні галузі науки, а тому пропонуємо Вашій увазі невеличку лекцію на тему «Розмноження рослин у культурі тканин та отримання оздоровленого садивного матеріалу. Культивування апексів», що буде підкріплена цікавим та пізнавальним відеоматеріалом.

Отож, ознайомимося з різними методами розмноження у культурі тканин та отримання оздоровленого садивного матеріалу.

1. Способи регенерації рослин та етапи мікроклонального розмноження.

Упродовж багатьох сторіч у сільському господарстві людство широко використовує вегетативне розмноження рослин (поділом куща, живцями, відводками, листками, вусами та ін.), але цей процес – тривалий та трудомісткий. Завдяки біотехнології на сьогодні розроблено принципово нові технології прискореного вегетативного розмноження майже для 2400 видів рослин, які одержали назву «мікроклональне розмноження рослин» (розмноження рослин іn vitro, тобто у пробірці).

Основою мікроклонального розмноження є регенераційна здатність тотипотентних рослинних клітин.

Термін «регенерація» (від лат. regeneratio – відновлення) – в біології означає відновлення організмом втрачених або пошкоджених тканин (органів), а також відновлення цілого організму.

Із зоології відомо про природну регенерацію дощового черв’яка, гідри, планарії та ін., а у рослин висока регенераційна здатність притаманна практично всім клітинам.

Регенерацію рослин у культурі іn vitro можна здійснити такими шляхами:

органогенез – утворення пагонів, коренів або рослин-регенерантів безпосередньо з експланту (апекса бруньки, листка, калусної тканини та ін.);

культура зародків (важливий засіб збереження нежиттєздатних зародків шляхом пророщування їх в умовах іn vitro, на штучному поживному середовищі);

соматичний ембріоїдогенез – утворення зародкоподібних структур із соматичних клітин рослин.

Процес мікроклонального розмноження іn vitro може бути двох видів:

Активація розвитку уже іприсутніх у рослині меристем, які знаходяться у верхівках стебла, в пазухових (сплячих) бруньках.
Формування зародкоподібних структур заново (через калусну тканину).

На практиці найбільш поширений перший тип розмноження, що зводить до мінімуму появу генетично змінених форм рослин. Органогенез при мікроклональному розмноженні рослин відбувається за таким сценарієм:

а) на штучне поживне середовище з певним балансом фітогормонів у контрольованих умовах температури й освітлення вміщують невеличку частину рослини (бруньку, верхівку 0,3-3 мм), що пускає пагони;

б) пагони відділяють і пересаджують на інше середовище для укорінення;

в) одержані рослини-регенеранти адаптують до природних умов.

Таким чином, мікроклональне розмноження (синонім – клональне мікророзмноження) – це масове нестатеве розмноження рослин у стерильних умовах, яке виключає появу генетично змінених форм.

Технологія мікроклонального розмноження рослин складається з таких основних етапів:

підбір експлантів і введення їх у культуру;
активація розвитку пагонів з експланту при підвищеній концентрації цитокінінів живильного середовища;
укорінення пагонів при збільшеній концентрації ауксинів у поживному середовищі;
переведення отриманих рослин зі стерильних умов у ґрунт, їх адаптація (перенесення з умов іn vitro в умови іn vivo).

2. Експланти, їх походження й введення в культуру.

Найбільш важливим моментом є вибір материнської рослини і експланта. Термін «експлант» застосовують для назви вихідного шматочка рослини, який вводять у культуру іn vitro. В якості експлантів використовують верхівки пагонів, бокові бруньки, частинки кореня або листка, черешок листка, суцвіття, пелюстки квітів, гіпокотиль проростаючого насіння та інші частини рослин.

Рис. 1. Схема мікроклонального розмноження рослин: а – вихідна рослина; б – різні типи експлантатів, які використовуються для мікророзмноження; в – ті самі експлантати в культурі in vitro; г – пряма регенерація рослин з існуючих в ізольованих експлантатах меристем або з меристем які утворюються з диференційованих клітин (наприклад, епідермісу) без виникнення калюсу; д – регенерація рослин із калюсу шляхом органогенезу (за: Кунах, 2005).

Для успішного проведення робіт із регенерації рослин вибір експлантів відіграє першорядне значення. Краще всього використовувати матеріал, вилучений зі здорових, сильних рослин. Вибір експланта залежить від виду, стану рослини-донора, фази її розвитку, сезону року. Значення має навіть положення експланта на рослині. Так, верхівки пагонів, взяті з верхніх гілок дерева, мають більшу швидкість розмноження, аніж верхівки з нижніх гілок. Більшість експлантів добре вводяться в культуру у фазу активного росту донорської рослини. Проте є рослини, експланти з яких утворюють пагони лише у стані спокою. Незрілі, молоді органи завжди більш пластичні з точки зору здатності до морфогенезу іn vitro, аніж старіючі, зрілі тканини та органи. Більше того, при виборі експлантів слід віддавати перевагу меристематичним тканинам, оскільки вони легше виживають у культурі, мають більшу швидкість росту й тотипотентність. Розмір експланта визначає також ступінь виживання іn vitro (крупніші за розміром верхівки пагона завжди краще виживають).

Донорські рослини, з яких збираються вилучити експланти, вирощують у якомога чистішому середовищі, уникаючи надмірного поливання, забруднення пагонів і листків. Важливими компонентами успіху є очистка і стерилізація рослинного матеріалу перед введенням його в культуру іn vitro.

Таким чином, відібраний і простерилізований експлант вводиться в культуру на спеціальне поживне середовище.

3. Активація розвитку пагонів та їх укорінення.

Усі рослини ростуть завдяки активності їх верхівкових меристем. Такі меристематичні тканини знаходяться на кінчику основного пагона, у пазухових бруньках, зародку – класичних експлантах для мікроклонального розмноження рослин .

Брунька – це зачатковий, нерозвинений пагін з дуже вкороченими міжвузлями. Вона складається з меристематичної зачаткової осі, яка закінчується конусом наростання. Нижче конуса наростання закладаються зачатки листків, різні за віком і розміром. Листки розташовані в бруньці один над одним. У пазухах зачаткових листків (примордіїв) утворюються горбочки – зачатки бічних (пазушних) бруньок. Отже, вегетативні бруньки можуть бути верхівковими (апікальними) і пазушними, розташованими в пазухах листків або брунькових лусочок.

Поняття апекс і конус наростання не можна ототожнювати. Пояснюється це тим, що під конусом наростання розуміють лише верхню (часто конусоподібну) частину апекса, де немає листкових зачатків (вище примордіальної зони) апекса. Тобто, під апексом мається на увазі цілий комплекс меристематичних клітин з різними функціями. Апекс – це частина бруньки, ростовий центр пагона. Завдяки діяльності його клітин формуються первинні тканини всіх органів, тобто йому властиві як гістогенні, так і органогенні процеси.

Таким чином, якщо наш експлант – верхівка пагона 0,25-0,30 мм у довжину, то в пазухах його зачаткових листочків знаходяться додаткові меристематичні тканини, що здатні формувати нові пагони. На другому етапі при підвищеній концентрації цитокінінів поживного середовища долається ефект апікального домінування в умовах іn vitro і утворюється цілий пучок пагонів першого, другого, третього і т.д. порядку. Цей процес називається проліферацією пагонів іn vitro.

Утворені пагони знову пересаджуються на те саме поживне середовище для подальшого одержання нових пагонів з його пазухових бруньок. Подібний процес можна продовжувати й одержувати величезні кількості пагонів за відносно короткий період часу.

Метод проліферації пазухових пагонів із апексів або бруньок є найбільш поширеним у практиці мікроклонального розмноження різних видів рослин. При утворені пагонів поживне середовище повинно містити цитокінінів більше, аніж ауксинів. Це «золоте правило пагоноутворення» має винятки для деяких видів рослин. У культурі іn vitro використовують такі цитокініни: кінетин, зеатин, БАП; ауксини: ІОК, ІМК, НОК, 2,4-Д. Співвідношення цитокінін/ауксин підбирається для кожної культури експериментально.

Важливе значення для активації формування пагонів мають умови освітлення і температури. Світло необхідне для морфогенезу і утворення хлорофілу. Використовують, як правило, люмінесцентні лампи з інтенсивністю світла 1000-1500 люкс. Оптимальним періодом освітленості для більшості рослин вважають проміжок часу 16 годин, температура – 20-25 ºС.

Існує метод отримання пагонів із калусної тканини, що також належить до мікроклонального розмноження, але застосовується мало, бо може призводити до генетичних змін у новостворених рослин-регенерантів.

4. Перенесення рослин іn vitro в умови вільного існування.

Після того, як утворилось багато пагонів, їх необхідно укорінити й одержати повноцінні рослини. Основні індуктори коренеутворення (ризогенезу) – ауксини. Для формування коренів пагони відділяють і висаджують на поживне середовище, яке містить ауксинів більше, аніж цитокінінів. Це – основне правило коренеутворення іn vitro, що має свої винятки. Під впливом ауксинів стимулюється поділ клітин паренхіми пагона, що приводить до диференціації кореневих зачатків у його базальній частині. Утворення адвентивних коренів може також спонтанно проходити при перенесенні пагонів на середовище без цитокінінів (особливо в однодольних рослин). Деякі дослідники вважають, що для індукції ризогенезу доцільно спочатку використовувати середовище без фітогормонів. Це пояснюється тим, що ефективність ауксинів при укоріненні зменшується під впливом цитокінінів попереднього етапу розмноження.

Рис. 2 Метод культури “няньки” для вирощування культури з одиночної клітини.

Рис.3 Вирощування рослин на поживному середовищі.

Ріст пагонів і їх подальше укорінення приводить до утворення невеличких рослин з 5-6 листочками. Стебло можна розрізати на 5-6 мікроживців, які за сприятливих умов виростають до нормальних рослин. Процес дозволяє безперервно одержувати великі кількості рослин.

Укоріненість пагонів іn vitro залежить від кількості їх субкультивувань до укорінення: зі збільшенням кількості пасажів укоріненість зростає і скорочуються строки появи коренів на пагонах.

Висновок. Регенераційна здатність рослин залежить від таких чинників: виду рослини, місця розташування експланта на рослині, сезонності відбору експланта, складу поживного середовища, фізичних факторів (температури, освітленності, вологості), кількості субкультивувань і тривалості безпересадочного культивування.

Перенесення рослин з умов іn vitro в умови іn vivo – важливий і найбільш трудомісткий заключний етап мікроклонального розмноження. Найкращим для пересадки є період, коли в рослини добре розростаються корені для поглинання мінеральних елементів ґрунту, а молоді листочки вже здатні до продуктивного фотосинтезу. Рослина стає повністю автотрофною для самостійного існування і її необхідно пересаджувати у природні умови.

Важливим аспектом роботи є вибір ґрунтового середовища, у яке переноситься рослина, здебільшого це суміш торфу з піском, перлітом або вермикулітом. Наприклад, для суниць, вишні, смородини використовують суміш – ґрунт : торф : пісок = 1:1:1. Перед висадкою у ґрунт корені рослин промивають у розчині фунгіциду (фундазол, каптан, бенолат). Висаджують не дуже загущено, щоб запобігти розвитку грибкових захворювань і сильному видовженню рослин у боротьбі за світло. У період вирощування щотижня рослини обприскують слабким розчином фунгіциду.

Фізіологічні особливості молодих листків (відсутність захисного воскового шару), а також кореневої системи (недостатньо закріплена у ґрунті, відсутність потужної зони кореневих волосків) не забезпечують нормального водного балансу рослин. Інтенсивна кутикулярна транспірація не компенсується надходженням води за допомогою тиску кореневої системи, що може призвести до прив’ядання й загибелі рослин. Саме тому високий рівень вологості (90-100%) повітря, у якому буде знаходитись рослина після пробірки – найважливіший фактор перших тижнів вирощування. Для цього використовують установки туманоутворення у теплицях, індивідуальне покривання рослин поліетиленовою плівкою або скляним посудом. Як правило, високий рівень вологості підтримують до утворення нового листка (два тижні і більше). Після цього рослини загартовують – готують до відкритого ґрунту: поступово знімають покриття з рослини і зменшують вологість до природної. При загартуванні рослин, як останній фазі адаптації, необхідно приділяти увагу оптимальному живленню рослин. Надлишкове підживлення призводить до жирування рослин, вони стають надмірно рослими й погано приживаються після перенесення у відкритий ґрунт.

Якщо робота проводиться у великих промислових масштабах, то період адаптації рослин бажано спланувати і проводити з березня по вересень, що скоротить до мінімуму витрати. Рослини, одержані у зимовий період, зберігають у холоді (+5 º….+8 º) при освітленні, а весною проводять усі названі вище процедури із перенесенням в умови вільного існування.

5. Генетична стабільність при мікроклональному розмноженні та переваги і недоліки клонального мікророзмноження рослин.

Метод клонального мікророзмноження дозволяє одержати до 1 млн. одиниць садивного матеріалу за один рік, що вже зроблено для суниці, гербери, хризантеми та ін. рослин.

Можливість розмноження протягом року незалежно від погодних умов. Наявність лабораторії і теплиці дозволяє це зробити.

Створення «банку» неінфікованого цінного селекційного матеріалу. У холодній кімнаті, при температурі +3º…+5ºС і освітленні, пробірочні рослини можуть зберігатися протягом декількох місяців без пересадки. Холодильник об’ємом 0,28 м³ вміщує до 2 тис. культуральних рослин. У відкритому ґрунті така ж кількість рослин займає від 5 до 6 га (для плодових культур залежно від схеми посадки).

Можливість широкого обміну рослинним матеріалом між регіонами і країнами. Зменшуються об’єми перевезення матеріалу, легше вирішуються карантинні питання.

Одержання безвірусного садивного матеріалу.

Щодо проблем, то для промислового впровадження мікророзмноження необхідно розробляти й удосконалювати механізацію та автоматизацію основних етапів роботи. На сьогодні більшість процесів виконується вручну.

Вузьким місцем технології мікророзмноження деяких культур залишається пересадка пагонів безпосередньо у нестерильні умови для укорінення і одержання повноцінних рослин. Велике значення при цьому відіграють субстрат, пересадка рослин, умови довколишнього середовища.

В Україні створюються лабораторії мікроклонального розмноження, виходячи з потреб селекції і насінництва. У той же час могли б мати велике значення і комерційні фірми-лабораторії. Для їх організації потрібно прогнозування рентабельності та виробництва виду продукції, ринкова ціна, місткість ринку, сезонність постачання.

6. Особливі перспективи для оздоровлення рослинного матеріалу від вірусних захворювань відкриває метод культивування верхівкових меристем іn vitro у поєднанні з методами термо- і хіміотерапії.

Віруси – неклітинні форми життя, які мають власний геном (молекулу ДНК або РНК) і здатні до відтворення лише в живих клітинах хазяїна (рослини, тварини, бактерії), тобто є паразитами на генетичному рівні.

Залежно від виду нуклеїнової кислоти розрізняють ДНК- і РНК-вмісні віруси, що зверху оточені білковою оболонкою – капсидом. Переважна більшість фітовірусів РНК-вмісні.

Віруси позбавлені багатьох ознак, притаманних усім живим істотам: у них відсутні спеціальні пристосування для самостійної циркуляції в природі, вони не можуть репродукуватись в ізольованому вигляді і в них відсутні енергетичні системи.

Віруси потрапляють у клітину найчастіше за допомогою комах або в результаті механічного пошкодження тканин рослини. Нуклеїнова кислота вірусу залишає білкову оболонку і стає активною: реплікується і транслюється у вірусні нуклеїнові кислоти і білки, з яких самозбираються нові віруси. Дочірні віруси виходять з клітини-хазяїна, яка гине. У природі їх розповсюдження забезпечується різними способами: через насіння, корені, бульби, цибулини, пилок, через ґрунт, рештки хворих рослин, воду, комах-перенощиків або зооспори деяких нижчих грибів. Найчастіше саме людина сприяє розповсюдженню вірусів при щепленні, підрізуванні, пасинкуванні або пікіровці рослин.

Варто зауважити, що найбільше вірусів міститься у нестиглому насінні, а в стиглому вони поступово інактивуються, що пояснюється переходом насіння до стану спокою й накопичення інгібіторів, які пригнічують активність вірусу (Московець С.М. 1971). Ураження відбувається шляхом повільного транспорту вірусів по рослині. Саме факт повільного переміщення вірусів забезпечує їх відсутність у новостворених меристематичних тканинах, що вилучаються й використовуються у практиці для мікроклонального розмноження рослин.

На сьогодні відомо понад 400 фітовірусів і ще більше вірусних захворювань у різних рослин. Класифікують захворювання на дві великі групи: мозаїки й жовтухи. Основна симптоматика мозаїк – нерівномірне (мозаїчне) забарвлення листків, обумовлене порушеннями пластидного апарату клітин; листки часто бувають зморшкуватими. Характерні ознаки жовтух – загальний хлороз листків, що мають жовтуватий відтінок і скручуються. Листя надзвичайно насичується вуглеводами, що призводить до їх підвищеної жорсткості й крихкості.

На практиці основними засобами боротьби з вірусними захворюваннями є виведення стійких та імунних сортів с. г. культур, знищення комах, бур’янів, хворих рослин, регулювання строків посіву та збирання с. г. рослин, фізичні та хімічні засоби обробки насіннєвого та садивного матеріалу, вакцинація та ін.

Перші дослідники, які працювали з культурою ізольованих тканин і органів рослин, проводили експерименти чисто фізіологічного напрямку. У 1934 році один із засновників цього методу П. Уайт (США) повідомив, що віруси відсутні у кінцівках коренів рослин, уражених вірусом тютюнової мозаїки. Подібні результати були одержані у 1949 році в дослідах М. Корнюа і П. Лімансе. Відсутність вірусів в апексах розміром 0,1 мм складає основу методу одержання оздоровлених (безвірусних) рослин з меристем іn vitro, який запропонували Ж. Морель і К. Мартен. У 1952 році вони одержали безвірусні жоржини від уражених рослин.

Чому віруси відсутні у верхівкових меристемах?

Найбільш сприятливими органами для репродукції вірусів є тканини листків. У вірусів відсутні будь-які спеціальні пристосування для самостійного (автономного) пересування по рослині, тому можна передбачити симпластичний або апопластичний шлях їх міграції по сформованих тканинах та органах. Відомо, що обмін речовин і органічний зв’язок між клітинами здійснюється порами, що мають власні, дуже маленькі отвори, крізь які проходять тяжі цитоплазми – плазмодесми. Завдяки плазмодесмам з’єднуються в єдине ціле цитоплазми усіх живих клітин і утворюється так званий симпласт.

Мікроскопічні дослідження свідчать, що клітини верхівкової меристеми у період активного поділу дрібні, з тонкою целюлозною оболонкою ізодіаметричної форми. Вони щільно зімкнені між собою, не мають міжклітинників.

Отже, існують такі спостереження:

Віруси повільно розповсюджуються по рослині;

Клітини меристем швидко діляться;

Серед клітин верхівкових меристем відсутні міжклітинники, недостатньо налагоджена система плазмодесм, що ускладнює апопластний і симпластний шлях переміщення вірусу.

Таким чином, маємо усі підстави зробити припущення, що анатомо-фізіологічні особливості верхівкових меристематичних клітин роблять неможливим надходження до них вірусів. Вірус не встигає за швидким утворенням перших груп меристематичних клітин у верхівці розміром близько 0,075-0,1 мм. Розмір меристем визначає поріг концентрації вірусних частинок.

Як правило, для ефективного звільнення від вірусів використовують шматочки меристем розміром 0,10-0,15 мм. Проте, чим менша за розміром меристема, тим складніше вона приживається на поживному середовищі і регенерується в цілу рослину. Метод мікроклонального оздоровлення стає більш надійним і ефективним при додатковій термообробці і хіміотерапії рослин.

Термотерапія рослин (дія високих температур) – один із ефективних методів профілактики і лікування вірусних захворювань. Піонером застосування термотерапії для лікування рослин вважають П. Кобуса, який у 1889 році використовував гарячу воду проти вірусного захворювання цукрової тростини. Новий етап у розвитку термотерапії почався у 1935 році, коли американець Л. Кункель застосував гаряче повітря для лікування персика від жовтухи, дрібноплідності і розеточності.

Різні методики оздоровлення рослин від вірусів методом термотерапії передбачають інактивацію вірусної інфекції – температурами 30-50ºC, які протягом певного періоду експозиції не завдають шкоди фізіології самої рослини. Цей метод дозволяє брати для оздоровлення більші за розміром меристеми, що набагато краще виживають на поживних середовищах іn vitro (0,3-0,8 мм). Застосування методу особливо ефективне при отриманні безвірусних рослин, що вегетативно розмножуються (картоплі, яблуні, кісточкових, винограду, хмелю, суниці, малини, квітів та ін.).

Широке впровадження в сільськогосподарську практику безвірусного садивного матеріалу картоплі стало можливим саме завдяки поєднанню методів верхівкових меристем і термотерапії. Ця технологія складається з таких етапів:

1. термічна обробка матеріалу (бульб або укорінених верхівок);

2. виділення верхівкових меристем і регенерація з них рослин;

3. індукція пагоно- і бульбоутворення;

4. одержання мікробульб картоплі іn vitro.

Застосування цього методу дозволяє за 3-4 місяці одержати 2-3 тис. рослин, придатних для висадки у ґрунт, тобто близько 20 тис. мікробульб за 9-10 місяців з однієї рослини. Це має велике значення для елітного насінництва. В Інституті картоплярства УААН цим методом оздоровлено понад 70 сортів картоплі. Одержаний таким чином матеріал розмножують протягом двох років у польових умовах, що дає можливість на третій рік мати достатню кількість елітного насінного матеріалу. На експериментальній базі Інституту картоплярства одночасно розмножують 30 тис. рослин іn vitro і одержують три врожаї на рік (це становить близько 100 тис. мікробульб). Розроблений метод скорочує строки розмноження картоплі з 10 до 3-х років.

Вчені вишукують антивірусні препарати, які виробляються самими рослинами. Позитивні результати одержані у цьому напрямку при використані екстрактів лаванди, ромашки, шавлії та ін. лікарських рослин.

Відома антивірусна дія антибіотиків. Іманін – антибіотик, вилучений зі звіробою, сприяє підвищенню стійкості томатів до деяких вірусних захворювань. Комплексне передсадивне застосування тіосечовини і гіберелінів для обробки бульб картоплі сприяє зниженню продукції Х і Y- вірусів у рослин.

Велике значення має рН середовище при самореплікації вірусу. У дослідах на картоплі встановлено, що при значеннях рН близько 10 відбувається дезагрегація вірусів і втрата їх активності.

Метод верхівкових меристем і хіміотерапія успішно доповнюють один одного при використанні панкреатичної РНК-ази, яку додають до поживного середовища. Відсоток здорових рослин-регенерантів на середовищі з РНК-азою у 1,5-2 рази вищий, аніж без неї. Щоб збільшити частку безвірусних меристемних рослин, до поживного середовища часто додають препарат «вірозол» (синтетичний рибоварин).

Існують інші методи отримання безвірусного рослинного матеріалу. Наприклад, метод мікрощеплення, який застосовують за умови, що насіння цитрусових, персика й багатьох плодових культур не передає вірусів і залишається здоровим. Рослини, що виросли у пробірці іn vitro з насіння, готують під бінокулярним мікроскопом для мікрощеплення – рослину зрізують, а на кінці залишка стебла роблять надріз, із яким щеплюють необхідний меристематичний експлант.

Найважливіша перевага мікророзмноження – одержання величезної кількості рослин – може перетворитись у дуже небезпечний недолік, якщо матеріал не буде перевірено на чистосортність і відсутність вірусів.

Окрім того, вірус може знаходитися в рослині у прихованому (латентному) стані і зовнішні ознаки не виявляються.

Фізичні й біологічні особливості вірусів потребують специфічних методів їх діагностики (метод електронної мікроскопії; індикаторний (біологічний) метод; метод імунодіагностики (імуноферментний аналіз).

А от як подібні процеси виглядають на практиці: